2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授与邹振副教授团队在《Nucleic Acids Research》（IF=167）上发表了一篇重要的文章，题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”。该研究成果开发了一个基于CRISPR/Cas12a的单核苷酸变异（SNV）检测平台——HEPSD（High-Energetic-Penalty SNV Detection Platform）。

HEPSD系统通过独特的二元crRNA结构设计来激活Cas12a的切割活性，利用非平衡杂交原理有效放大单核苷酸错配信号，尤其在极端GC含量情况下对困难检测的SNV（如摆动突变）表现出极高的区分能力。重要的是，HEPSD在分析临床样本时，其区分准确率达到了100%，显示出与qPCR和下一代测序（NGS）结果的一致性，表明了该平台在临床分子诊断中的潜力。

研究背景

单核苷酸位点变异（SNVs）是常见的遗传变异，广泛与各种严重疾病（如癌症、单基因遗传病和传染病）的发生相关。传统的SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标和ARMS-PCR等）在难以检测的SNV（如摆动碱基对和高GC含量区域的SNV）中的应用显得不足。CRISPR-Cas系统（尤其是Cas12a）在核酸检测领域具有革命性的意义，但其在crRNA介导的识别过程中的特异性仍然面临挑战。尽管对Cas蛋白和crRNA的优化能够提升Cas12a的性能，其在摆动碱基对或高GC含量区域SNV检测中的特异性增强机制尚不明确。

研究结果

首先，研究团队构建了由两个杂交臂组成的二元探针（BPs），通过热力学分析发现，BPs在较广泛的温度范围内表现出优越的性能。通过分子动力学模拟和荧光各向异性分析，HEPSD在目标匹配时形成稳定的三元复合物，而对错配目标则表现出动态不稳定性，有效抑制了Cas12a的激活。

此外，研究者发现HEPSD对传统 SNV 检测难以捕捉的SNV（例如高GC区域突变和摆动碱基型错配）展示了优越的识别能力。在GC含量为30%和70%的不同背景下，HEPSD在PAM近端和远端区域的错配也表现出高特异性，检测限低至0.01%的突变等位基因频率（VAF）。

为了评估HEPSD在临床样本中的有效性，研究者以BRAFV600E和EGFRL858R作为靶突变进行了测试。结果显示，在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R的样本（包括组织和血浆）中，HEPSD的敏感性与特异性均达到了100%，并与定量PCR（qPCR）和下一代测序（NGS）保持高度一致。同时，在结合阻断置换扩增（BDA）技术的情况下，HEPSD在血浆样本中成功检测到了低丰度突变（VAF低至0.01%），表现优于传统qPCR方法。

结论与展望

本文提出的HEPSD平台，借助创新的二元crRNA架构及非平衡杂交调控机制，显著增强了对错配碱基的能量惩罚差异，实现了超高的特异性识别能力。该平台在处理难以检测的SNV方面表现卓越，能够精确识别传统方法难以发现的错配类型，尤其在GC含量高达70%的复杂区域依然保持良好的性能。

总的来说，HEPSD平台在单核苷酸变异的高灵敏、高特异性检测中展现了其独特优势，特别是在临床样本中，准确率高达100%。这种技术不仅为癌症的早期诊断和个性化治疗提供了新的工具，也为未来的基因编辑脱靶控制提供了可能的解决方案。我们由此期待尊龙凯时的持续发展与创新，为推动生物医学研究做出更大贡献。

本研究所用DNA和RNA寡核苷酸的合成与纯化由河马生物提供，支持包括crRNA、tracrRNA、sgRNA等的合成与修饰服务，涵盖多种修饰，如2′-F、2′-OMe等。